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本试剂盒是一种无需洗涤或收集细胞的通过化学发光法直接测定细胞内海肾萤光素酶(sea pansy (Renilla reniformis) luciferase，简称Renilla luciferase)活性的超高灵敏度、高信号稳定性的一步法检测试剂盒。与培养液等体积的检测试剂加入到细胞培养板内反应5分钟，即可进行化学发光检测。本试剂盒使用灵活便捷、测定样品的线性范围宽、检测灵敏度高，特别适合于Renilla luciferase表达水平较低的样品检测。另外，本试剂盒也可以用于裂解并收集保存的细胞样品的检测。

• 本试剂盒的性能基本达到甚至在有些方面优于国外主要同类产品。
  本试剂盒的用途与百奥莱博的同类产品Seansy-Lurg海肾萤光素酶报告基因检测试剂盒(简称Seansy-Lurg)及Promega公司的Renilla-Glo Luciferase Assay System (简称Renilla-Glo)基本相同，但是本试剂盒的检测灵敏度显著优于Seansy-Lurg和国外同类产品(Competitor P)，发光强度比Seansy-Lurg提高了约2～4倍，比国外同类产品提高了约4～6倍；化学发光的信号稳定性稍低于Seansy-Lurg和国外同类产品(Competitor P)，半衰期约15分钟。本试剂盒与Seansy-Lurg及国外同类产品(Competitor P)的检测效果比较参见图1。
  本试剂盒发光强度高，特别适用于Renilla luciferase表达水平低的样品检测。对于相同的样品，本试剂盒的发光效果比Seansy-Lurg强约2～4倍，比国外同类产品(Competitor P)强约4～6倍。实测效果可能会因细胞种类、检测环境等的不同有所差异。
  
  图1.Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶报告基因检测试剂盒(Seansy-Lurg Plus)和百奥莱博的同类产品Seansy-Lurg海肾萤光素酶报告基因检测试剂盒(Seansy-Lurg)及国外同类产品(Competitor P)对转染海肾萤光素酶报告基因质粒的HeLa细胞的检测效果。实际读数会因细胞种类、转染效率、所用质粒、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒的检测灵敏度高，测定样品的线性范围宽。
  96孔板中，通常本试剂盒可以在20万个细胞范围内呈现良好的线性关系。不同的细胞、不同的萤光素酶表达水平时的检测细胞数量的上限可能有所差异，当海肾萤光素酶表达水平很高时，可能只在10万个细胞范围内有良好的线性关系，但是化学发光读数还是会随着细胞数量的增加而继续升高的。本试剂盒对转染海肾萤光素酶报告基因质粒的不同数量的HeLa细胞的检测效果参见图2。
  
  图2.本试剂盒对转染海肾萤光素酶报告基因质粒的不同数量的HeLa细胞的检测效果。根据共转的EGFP表达质粒，实测转染效率约为60～70%。实际读数会因细胞种类、转染效率、所用报告基因质粒、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 本试剂盒操作简单，检测速度快，完成整个检测流程仅需约10分钟。
  本试剂盒比其它海肾萤光素酶测定方法更加简单快捷。细胞可以在同一块多孔板中培养和检测，无需洗涤细胞，也无需更换或去除培养液，只需把试剂盒提供的Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物和Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液按照1:100的比例混合配制成Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液，再与培养的细胞等体积混合，反应5分钟后即可进行化学发光检测。
  
• 本试剂盒稳定性好。
  本试剂盒中的Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液稳定性好，反复冻融10次、4℃或室温保存3天对检测效果基本无影响。37℃保存1天，仍可保留90%以上的检测效果。
  
• 本试剂盒使用灵活便捷。
  本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合大量样品的高通量检测(high-throughput screening)。本试剂盒不仅可以等体积加入到细胞培养孔中进行直接检测，也可以先使用海肾萤光素酶报告基因细胞裂解液（货号：YTB2029）裂解并收集细胞后再用本试剂盒进行检测。
  
• 本试剂盒兼容性强。
  本试剂盒兼容各种常见培养液，正常培养液中的酚红、10%以内的胎牛血清或小牛血清、2%以内的DMSO或乙醇对信号和稳定性基本没有影响，常用的盐类或金属离子在正常浓度下也基本没有影响。

海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide。在Coelenterazine氧化的过程中，会发出波长为480nm左右的生物萤光(bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR区克隆在luciferase的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。海肾萤光素酶一方面常用作萤火虫萤光素酶报告基因检测的内参，以消除由于质粒的转染效率不同而带来的误差；另一方面海肾萤光素酶也可以和萤火虫萤光素酶一样被用于常规的报告基因检测。本试剂盒的检测原理参考图3。

图3.海肾萤光素酶的检测原理图。

组分	100T	1000T
Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液	10mL	100mL
Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)	100μL	1mL

保存：-20℃，避光，有效期6个月。


对于96孔板，推荐使用100μL细胞培养液和100μL的检测试剂，总体积为200μL，此时本试剂盒分别可以进行100次或1000次检测。对于384孔板，推荐使用25μL细胞培养液和25μL的检测试剂，总体积为50μL，此时本试剂盒可以进行400次或4000次检测。也可以用其它体积的试剂进行检测，但细胞培养液和检测试剂体积的比例须为1:1。虽然我们有检测数据显示适当减少检测试剂的用量很可能仍然会得到较好的检测结果，但对于细胞数量偏多、细胞数量特别少或者重复性要求比较高的情况，建议按照推荐用量进行检测。

• Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液，-20℃保存一年有效；Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)，-20℃避光保存6个月有效，-80℃避光保存一年有效。
  
• 本试剂盒的化学发光信号随时间的变化衰减较快，半衰期仅约15分钟，为取得比较满意的检测效果请严格控制检测时间，尽量在加入检测试剂后5到10分钟内进行检测。
  
• 由于萤光素酶的活性对温度比较敏感，所以反应前细胞、Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液均需达到室温后再进行测定。可将检测缓冲液在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后使用。
  
• 本试剂盒中的Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液在反复冻融过程中，可能会导致检测试剂中出现少量沉淀，此时宜平衡至室温，并尽量溶解。如仍有残留的不溶物，可以离心去除后使用，经测试不会影响后续的检测效果。
  
• 请使用适合于细胞培养的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用百奥莱博的GoldBalb全黑96孔细胞培养板(货号：YTB002)或GoldBalb全白96孔细胞培养板(货号：YTB001)。
  
• Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发，有时会在初次使用时发现体积明显小于0.1mL的情况，此时用无水乙醇把体积补足至0.1mL，并混匀后即可使用。
  
• Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用，-20℃可以保存一周。随着保存时间的延长检测效果会不断下降，因此不可配制成工作液后长期保存。
  
• 待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰萤光素酶反应，从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的细胞培养液对照孔排除溶剂的干扰。经测试，最终反应体系中DMSO含量在2%以内不会对反应产生影响。
  
• 为避免细胞转染效率的差异而带来的误差，如果有必要，可以同时转染萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)的报告基因质粒作为内参，采用百奥莱博的Dual-Lurg双萤光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YTB2109)进行检测。
  
• 如果希望先裂解并收集细胞样品，然后再使用本试剂盒进行检测，须单独采购海肾萤光素酶报告基因细胞裂解液（货号：YTB2029）。其它裂解液未经测试。

• 细胞的准备：
  使用适合进行化学发光检测的96孔板，每孔接种100μL细胞(如使用384孔板，每孔接种25μL细胞，具体用量视不同类型的384孔板而定)，同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照，按照细胞培养和细胞转染的常规方法培养和转染细胞。如有需要，可加入药物处理细胞。
  
• 检测试剂的准备：
  
  • 融解Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)置于冰浴或冰盒上备用。
    
  • 按照96孔板每孔100μL (384孔板每孔25μL)的量，配制适量Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液。按照1:100的比例混合适量Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)和Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液，即配制成Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液。例如，5mLSeansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测缓冲液中加入50μL Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约5mLSeansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液。
    
    • 严格来说100X底物需要按照1:99进行稀释和配制，为便于计算和操作，按照1:100进行操作也可以获得一致的检测效果。
• 萤光素酶检测：
  
  • 取出细胞培养板在室温平衡10分钟(通常不宜超过30分钟)。
    
  • 96孔板每孔加入100μL Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测工作液(384孔板每孔25μL)。
    
  • 室温(约25℃)孵育5分钟，使发光信号趋于稳定。
    
  • 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25～1秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
• 裂解并收集细胞后的检测(本步骤仅当细胞量比较大的情况下，例如细胞培养在培养皿或6孔板中时，可以考虑采用)：
  
  • 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的海肾萤光素酶报告基因细胞裂解液（货号：YTB2029）；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量萤火虫萤光素酶报告基因细胞裂解液。
    

    器皿类型	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
    报告基因细胞裂解液(μl/孔)	100	150	200	300	500

    • 如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100μL。
  • 充分裂解后，10000～15000g离心3～5分钟，取上清用于测定。
    
    • 细胞裂解后可立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
  • 取20μL样品，加入100μL已经融解并平衡至室温的Seansy-Lurg Plus海肾萤光素酶检测试剂，适当混匀。
    
  • 室温(约25℃)孵育5分钟，使发光信号趋于稳定。
    
    • 如果对于数据的稳定性的要求不太高，可以忽略本步骤，在混匀后立即进行化学发光检测。
  • 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25～1秒或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。

• Luminometer和荧光分光光度计有何不同？
  荧光分光光度计检测的样品本身不能发光，样品需要由特定波长的激发光激发，然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光，不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能，即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
  
• 可以进行萤光素酶报告基因检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测？
  是。萤光素酶报告基因的检测原理和本试剂盒的原理相同，可以用相同的仪器测定。

附录：不同货号的荧光素酶报告基因检测试剂盒比较和选择

产品货号	YTB2101	YTB2102	YTB2103	YTB2104	YTB2304	YTB2109	YT271	YT272	YT273
产品简称	Bright-Lurg	One-Lurg	Steady-Lurg	Seansy-Lurg	Seansy-Lurg Plus	Dual-Lurg	Fire-luc	Reni-luc	Both-luc
检测对象	萤火虫 萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	海肾 萤光素酶	海肾 萤光素酶	双萤光素酶	萤火虫 萤光素酶	海肾 萤光素酶	双萤光素酶
检测方法	一步法直接检测						两步法收集细胞后检测
检测灵敏度	特别灵敏	非常灵敏	较灵敏	较灵敏	非常灵敏	非常灵敏	非常灵敏	特别灵敏	特别灵敏(Firefly) 非常灵敏(Renilla)
信号强度	特别高	非常高	较高	较高	非常高	非常高	非常高	特别高	特别高(Firefly) 非常高(Renilla)
信号半衰期	0.5～1小时	1～2小时	5～6小时	1～2小时	15分钟	1～2小时	约60分钟	5～10分钟	＞1小时(Firefly)
产品稳定性	较稳定(冻融10次保留90%，室温3天保留55%)	较稳定(冻融10次保留90%，室温3天保留60%)	较稳定(冻融10次保留85%，室温3天保留50%)	非常稳定(冻融10次无影响，室温3天保留80%)	特别稳定(冻融10次或室温3天，无显著影响)	较稳定(冻融10次保留95%、90%，室温3天保留50%、95%)	较稳定	较稳定	较稳定
线性范围(细胞数)	50～10万个						-
推荐指数	★★★★★	★★★★	★★★★	★★★★★	★★★★★	★★★★★	★★★★	★★★★	★★★★

不同报告基因检测试剂盒的选择：

• 对于96孔板、384孔板中细胞内荧光素酶活性测定或高通量检测时，推荐使用Bright-Lurg (货号：YTB2101)、One-Lurg (货号：YTB2102)、Steady-Lurg (货号：YTB2103)、Seansy-Lurg (货号：YTB2104)、Seansy-Lurg Plus (货号：YTB2304)和Dual-Lurg (货号：YTB2109)这六款一步法直接检测试剂盒。与Fire-luc萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT271)、Reni-luc海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT272)和Both-Luc双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT273)这三款收集细胞后检测的两步法试剂盒相比，一步法更加简单快捷，细胞可以在同一块多孔板中培养和检测，无需洗涤细胞，无需更换或去除培养液，也无需裂解和收集细胞，只需把试剂盒中对应的荧光素酶检测试剂与培养细胞等体积混合，反应数分钟后即可进行化学发光检测。两步法检测试剂盒，需要先裂解并收集细胞或组织样品，然后再进行测定。
  
• 对于使用培养皿、6孔板等细胞样品比较多的情况下，推荐使用萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT271)、海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT272)和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：YT273)这三款两步法检测试剂盒。先使用此类试剂盒配套的报告基因检测裂解液裂解并收集细胞样品，样品的用量可以根据细胞内荧光素酶的表达水平在20～100μL范围内进行适当调整，而且制备的样品如果不能立即检测，也可以先冻存待后续检测。同时，裂解的细胞样品也可以用于Western检测等。裂解后的样品也可以使用Bright-Lurg (YTB2101)、One-Lurg (货号：YTB2102)、Steady-Lurg (货号：YTB2103)、Seansy-Lurg (货号：YTB2104)、Seansy-Lurg Plus (货号：YTB2304)和Dual-Lurg (货号：YTB2109)这六款一步法直接检测试剂盒进行检测的，此时检测试剂的推荐用量为100μL，推荐的样品体积为20μL。
  
• 对于一步法萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，如果希望发光信号比较强，并在30分钟内即可进行检测，推荐使用Bright-Lurg；如果对信号稳定性要求特别高，需要批量或连续操作，推荐使用Steady-Lurg；如果对发光信号和稳定性都有要求，推荐使用信号强度和稳定性都比较折中的One-Lurg。对于常规的实验室检测，优先推荐使用Bright-Lurg。
  
• 对于一步法海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒，如果样品中荧光素酶活性比较低，希望发光信号比较强，并在10分钟内即可进行检测，推荐使用具有超高灵敏度的Seansy-Lurg Plus；如果对信号稳定性要求比较高，需要批量或连续操作，推荐使用Seansy-Lurg。

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